Fortgeschrittene molekulare Züchtung bei Bioenergiepflanzen beruht auf der Fähigkeit, die genetische Vielfalt massiv zu beproben. Die Genotypisierung durch Sequenzierung ist zu einer weit verbreiteten Methode für eine kostengünstige Genotypisierung geworden. Es erfordert grundsätzlich keine Anfangsinvestition für das Design im Vergleich zu Array-basierten Plattformen, die sich als sehr robuste Assays erwiesen haben. Letzteres hat jedoch den Nachteil, dass es an die genetische Vielfalt gebunden ist, die bei der Auswahl und dem Design berücksichtigt wurde. Davide Scaglione und Kollegen stellen eine neue Möglichkeit vor, die Vorteile beider Technologien zu kombinieren.
Herr Scaglione sagte: „Arrays schauen sich nur die Katalogmutationen genau an, niemals neue. Stattdessen sucht die Genotypisierung durch Sequenzierung immer nach neuen Mutationen, während kurze DNA-Stücke durchgelesen werden. Zusammen mit dem Zustand der „Katalog“-Site untersuchen wir zusätzliche Basen der DNA und wenn ein neues Allel vorhanden ist, wird es erkannt und möglicherweise verwendet, um eine Phänotyp-Assoziation zu finden. Eine Assoziation könnte nicht nur mit Katalog-Allelen gefunden werden, da der Phänotyp von Allelen vererbt werden könnte, die zuvor nicht bestimmt wurden.“
Ein Problem besteht darin, dass sich die Genotypisierung durch Sequenzierung mit zufälliger Probenahme genomischer Loci über Restriktionsenzyme oder zufälliges Priming zwar als schnell und bequem erwiesen hat, ihr jedoch die Fähigkeit fehlt, auf bestimmte Regionen des Genoms abzuzielen und eine hohe Reproduzierbarkeit in allen Labors aufrechtzuerhalten.
Scaglione und Kollegen stellen eine erste Anwendung der Single-Primer-Anreicherungstechnologie (SPET) vor, die ein hocheffizientes und skalierbares System bietet, um zielgerichtete sequenzbasierte große Genotypisierungsdatensätze zu erhalten und die Lücken zwischen Array-basierten Systemen und traditionellen sequenzierungsbasierten Protokollen zu schließen. Um die SPET-Leistung vollständig zu untersuchen, führten sie in zehn Jahren eine Benchmark-Studie durch Zea Mays Linien und eine groß angelegte Studie einer natürlichen Schwarzpappelpopulation von 540 Individuen mit dem Ziel, Polymorphismen zu entdecken, die mit Biomasse-bezogenen Merkmalen verbunden sind.
Ihre Ergebnisse zeigten die Fähigkeit dieser Technologie, dichte Genotypinformationen über ein angepasstes Panel ausgewählter Polymorphismen bereitzustellen und gleichzeitig Hunderttausende von ungezielten variablen Stellen zu liefern. Dies bot eine ideale Ressource für die Assoziationsanalyse natürlicher Populationen, die unerforschte allelische Diversitäten und Strukturen beherbergen, wie z. B. in der Schwarzpappel.
Die Verbesserung des Sequenzierungsdurchsatzes und die Entwicklung effizienter Bibliotheksvorbereitungsmethoden haben es möglich gemacht, gezielte Genotyping-by-Sequencing-Experimente kostengünstig mit Systemen zur Reduzierung der zufälligen Komplexität oder traditionellen Array-basierten Plattformen durchzuführen und gleichzeitig die Hauptvorteile von beiden beizubehalten Technologien.
„Diese Forschung wird die Nutzung der gezielten Sequenzierung als Methode der Wahl für die molekulare Züchtung und genomische Selektion bei Nutzpflanzenarten fördern, insbesondere für solche mit begrenzten Ressourcen“, sagte Herr Scaglione.
