Genome-Editing-Technologien sind zu wertvollen Werkzeugen in vielen Aspekten der wissenschaftlichen Forschung geworden und erleichtern beispielsweise die Identifizierung von Genen, die an der Entwicklung beteiligt sind, oder die Bestimmung von Proteinfunktionen. Sie arbeiten, indem sie Brüche innerhalb des Genoms erzeugen, die dann repariert werden, indem sie die Enden der DNA wieder verbinden. Während dieses Prozesses treten häufig Fehler auf, die möglicherweise zu Funktionsverlustmutationen führen. Da außerdem beide DNA-Stränge gebrochen sind, es bietet die Möglichkeit, neue DNA-Sequenzen in das Genom einzubauen.

Das CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas (CRISPR-associated) System ist eine solche Methode der Genombearbeitung. Es ist schwierig geworden, es zu ignorieren, da es sowohl von der wissenschaftlichen Gemeinschaft als auch von den Medien große Aufmerksamkeit erhalten hat. Eine Geschichte, die viel Aufmerksamkeit erregte, war die Zulassung eines Labors mit Sitz in London Verwenden Sie die CRISPR-Genombearbeitung an menschlichen Embryonen. Mehrere Artikel haben auch die große Zahl möglicher Anwendungen dieser Technik bei Tieren aufgezeigt, zum Beispiel Rinder zu produzieren, die keine Hörner entwickeln und daher die Notwendigkeit vermeiden, sich schmerzhaften Verfahren zu unterziehen, um sie zu entfernen. Der Grund für diese Begeisterung über CRISPR liegt zum Teil an seiner Einfachheit und Effektivität.

Das CRISPR-System vom Typ II benötigt nur eine crisprRNA (crRNA), eine transaktivierende crRNA (tracrRNA) und ein Cas9-Protein. Die RNA-Sequenzen können fusioniert werden, um eine einzelne guideRNA (gRNA) zu erstellen. Dies kann reprogrammiert werden, indem eine 20-bp-Region, die als Spacer-Sequenz bekannt ist, geändert wird, um das Cas-Protein auf fast jede Region innerhalb des Genoms zu lenken, die als Protospacer bezeichnet wird. Das Cas9-Protein erkennt eine 3-bp-Erkennungssequenz innerhalb des Genoms, die als Protospacer Adjacent Motiv (PAM) bekannt ist. Dadurch kann es binden und einen Bruch innerhalb der DNA-Sequenz einführen, genau 3 bp stromaufwärts von PAM (Belhaj et al., 2013). Anders als bei alternativen Techniken zum Einbringen von DNA-Brüchen, wie z TALENskönnen verschiedene genomische Regionen leicht angesteuert werden, indem einfach die RNA-Sequenzen modifiziert werden, die verwendet werden, um auf das Cas-Protein abzuzielen.

Eine aktuelle Studie von Gao et al. (2016) versuchten, einen Weg zu entwickeln, um vererbbare Mutationen, die mit CRISPR/Cas9 in der T2-Generation von erstellt wurden, effektiv zu identifizieren Arabidopsis. Derzeit verwendete Techniken sind zeitaufwändig und arbeitsintensiv. Durch Einschließen eines fluoreszierenden Proteins in das CRISPR-Plasmid, unter a CRISPR / Cas9 -Vektor-Promotor konnten die Autoren Samen der mutierten Pflanze, die immer noch das Cas9-Protein exprimierten, mithilfe einfacher Mikroskopietechniken leicht durchmustern. Dies ist wichtig, wenn versucht wird festzustellen, ob eine Mutation vererbbar ist, da eine T2-Pflanze, die immer noch das CRISPR-Konstrukt exprimiert, wahrscheinlich eine Mutation aufgrund der fortgesetzten Aktivität von Cas9 aufweist, anstatt sie von der Elternpflanze geerbt zu haben.

Ein wesentlicher Nachteil des CRISPR-Systems sind die hohen Werte an Off-Target-Mutationen, die dadurch eingeführt werden können. Daher ist es wichtig, genau zu bestimmen, ob die Cas9 Das Gen wurde ausgesondert, da Pflanzen, die weiterhin das Cas9-Protein exprimieren, diese unerwünschten Modifikationen mit viel größerer Wahrscheinlichkeit an anderer Stelle im Genom entwickeln. Darüber hinaus könnte eine fortgesetzte Expression dazu führen, dass somatische Mutationen fälschlicherweise als vererbbar identifiziert werden, was die Zeit erheblich verlängert, die für das Screening auf Pflanzen benötigt wird, die die von CRISPR/Cas9 abgeleiteten Mutationen in nachfolgenden Generationen enthalten.

Mehrere Studien haben über den erfolgreichen Einsatz von CRISPR/Cas9 in Pflanzen berichtet (Bortesi und Fischer, 2015), jedoch wurde wenig Wert darauf gelegt, sicherzustellen, dass das Cas9-Protein ausgesondert wurde. Zukünftige Studien, insbesondere solche, die vererbbare Mutationen erfordern, sollten sich stärker auf die Pflanzen konzentrieren, die die Mutation ohne fortgesetzte Expression des CRISPR/Cas9-Konstrukts enthalten. Dies wird die Screeningzeit für Pflanzen, die die von CRISPR/Cas9 abgeleiteten Mutationen enthalten, erheblich verkürzen und die Wahrscheinlichkeit von Off-Target-Mutationen an anderer Stelle im Genom verringern. Derzeit wurde diese Arbeit mit dem beliebten Modellorganismus durchgeführt Arabidopsis, aber es wird interessant sein zu sehen, ob solche Techniken für den Einsatz in anderen Anlagensystemen erweitert werden können.