Was passiert hinter diesen Mauern? Diese grundlegende Frage hat Generationen von Botanikern seit der ersten mikroskopischen Beobachtung von Pflanzenzellen im Jahr 1665 fasziniert und wird in den kommenden Jahrhunderten sicherlich noch viele weitere beschäftigen. Seitdem haben wir viel über das Innenleben von Pflanzen gelernt. Viele dieser Entdeckungen wurden jedoch nicht durch direkte Bildgebung gemacht, sondern durch indirekte Messungen, gefolgt von vernünftigen Schlussfolgerungen. Die farbenfrohen Darstellungen intrazellulärer Prozesse in Lehrbüchern sind größtenteils Annäherungen an das, was man schlussfolgern kann, wenn man den Zellinhalt extrahiert, ihn in Reagenzgläsern mit einigen Chemikalien schüttelt, diesen Cocktail durch teure Maschinen laufen lässt und sich die Zahlen dieser Instrumente ansieht lange genug ausspucken. Es handelt sich nicht um reale Bilder dessen, was ist, sondern um nachdenkliche Vorstellungen dessen, was sein könnte. Lange Zeit kamen Wissenschaftler einer lebensechten Darstellung am nächsten mit zytologischen Bildern, die von histologischen Präparaten abgestorbenen Gewebes nach Fixierung und Färbung angefertigt wurden. Dabei handelte es sich um in Zeit und Raum eingefrorene Momentaufnahmen, die nichts über dynamische Prozesse verrieten und die Forscher über die inneren Aktivitäten, die das Leben definieren, im Dunkeln tappen ließen.

Allerdings wurde bereits Mitte des 19. Jahrhunderts eine Möglichkeit entdeckt, das Unsichtbare sichtbar zu machenth-Jahrhundert durch den Physiker George Gabriel Stokes in einer Chininlösung. Die transparente und farblose Flüssigkeit leuchtete in einem himmlischen Blau, wenn sie am äußersten Rand eines Spektrums von Sonnenlicht platziert wurde, das von einem Prisma gestreut wurde. Voller Ehrfurcht vor dem, was er gesehen hatte, schrieb Stokes: „Es war sicherlich ein merkwürdiger Anblick zu sehen, wie die Röhre augenblicklich aufleuchtete, wenn sie in die unsichtbaren Strahlen getaucht wurde: es war buchstäblich Dunkelheit sichtbar. Insgesamt wirkte das Phänomen etwas unheimlich.“ Es ist dieses Phänomen, über das Nachtclubbesucher heutzutage staunen, wenn sie ihren Gin Tonic neben einem Schwarzlicht genießen, das einen japanischen Meeresbiologen in den Bereich der Nobelpreisträger erhoben hat und das die Macht besitzt, Licht auf die intrazelluläre Dynamik zu werfen und revolutionierte die Molekularbiologie.

Stokes bezeichnete die von ihm beobachtete Lichtemission als „Fluoreszenz“. Sie tritt auf, wenn bestimmte Atome oder Moleküle durch Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden und nach sehr kurzer Zeit Licht einer längeren Wellenlänge emittieren. Etwa ein Jahrhundert nach Stokes sammelte Osama Shimomura fast 10,000 Exemplare der Qualle Äquorea Victoria in pazifischen Gewässern, um das Geheimnis des verführerischen Leuchtens des Tieres zu lösen und erfolgreich ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) zu extrahieren. Es sollte noch etwa 30 Jahre dauern, bis GFP sequenziert und geklont war, was seine Expression in anderen Organismen ermöglichte und es zu einem heutzutage unverzichtbaren Werkzeug für nichtinvasive Verfahren machte in vivo Analyse physiologischer Aktivitäten auf subzellulärer oder organisatorischer Ebene.

Die ortsgerichtete Mutagenese des ursprünglichen GFP hat eine Vielzahl fluoreszenzerzeugender Moleküle, sogenannte Fluorophore, mit unterschiedlichen photophysikalischen Eigenschaften hervorgebracht. So können verschiedene Proteine ​​gleichzeitig mithilfe spektral getrennter Fluoreszenzmarkierungen sichtbar gemacht werden. Nicht nur deren Lokalisierung, sondern auch mögliche Wechselwirkungen zwischen interessierenden Proteinen sind auf diese Weise nachweisbar. Damit Proteine ​​interagieren können, müssen sie sich nur wenige Nanometer nahe kommen. Wenn der Abstand zwischen den angebrachten Fluorophoren klein genug wird, kann die Energie eines von einem absorbierten Laserstrahls auf das andere übertragen werden, was die Fluoreszenzlebensdauer und Lichtemissionsausbeute des Donor-Fluorophors verringert und die Fluoreszenz des Akzeptors erhöht. Dieser sogenannte Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) wird mit der Fluoreszenzlebensdauer-Bildmikroskopie (FLIM) aufgezeichnet und analysiert – einer Technik, mit der Forscher messen können, wie lange ein Fluorophor im angeregten Zustand verbleibt, bevor es Licht erzeugt.

Allerdings ist die Verwendung der Fluoreszenzanalyse in Pflanzen aufgrund der hohen internen Autofluoreszenz von Verbindungen wie Chlorophyll oder Zellwandlignin bekanntermaßen eine Herausforderung. Signale von fluoreszierend markierten Proteinen mit geringer Häufigkeit werden daher oft durch innere „Lichtverschmutzung“ übertönt. Workarounds zur Erhöhung des Signal-Rausch-Verhältnisses, wie etwa die Expression von Proteinen unter stärkeren Promotoren, können leicht zu Artefakten und Datenfehlinterpretationen führen.

Petutschnig et al. (2024) präsentieren ein neues Paar Fluorophore mit ausgezeichneter Helligkeit, das für nicht-invasive Zwecke eingesetzt werden kann in vivo Proteininteraktionsanalyse, wie in diesen Epidermiszellen von Arabidopsis-Pflanzen dargestellt. Das linke Feld zeigt die Fluoreszenzlebensdauer der Fluorophore, wenn sie einzeln ausgedrückt werden. Im rechten Feld wurden mCitrine und mScarlet-I kombiniert, um ein Fusionsprotein zu bilden. Die große Nähe zwischen den Fluorophoren ermöglicht die Energieübertragung vom Donor mCitrine zum Akzeptor mScarlet-I, wodurch die Lebensdauer des Donors deutlich verkürzt wird. 

Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben Dr. Elena Kristin Petutschnig und Kollegen etablierte ein neuartiges Paar von Fluorophoren Mit überlegenen Eigenschaften, die sie kürzlich im Journal of Experimental Botany vorstellten. Der Fluoreszenzdonor mCitrine und der Akzeptor mScarlet-I (benannt nach ihrer jeweiligen gelben und roten Lichtemission) überlappen sich in ihren Lichtabsorptions- und Emissionsspektren – eine Voraussetzung für die Untersuchung von Proteininteraktionen mittels FRET/FLIM. Sie weisen eine exzellente Helligkeit auf und eignen sich daher ideal für Proteine ​​mit niedriger Expressionsstärke. Die Autoren validierten die Funktionalität der Fluorophore anhand zweier Komponenten eines Zellrezeptorkomplexes, der eine Pilzverbindung detektiert und eine pflanzliche Abwehrreaktion auslöst. Dabei deckten sie bisher unbekannte Details über die Interaktion der Komponenten auf. Das Fluorophorpaar liefert somit neue Erkenntnisse über intrazelluläre Prozesse, und die Arbeit birgt großes Potenzial, die Vorgänge hinter den pflanzlichen Zellwänden weiter zu erhellen.

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Petutschnig EK, Pierdzig L, Mittendorf J, Niebisch JM, Lipka V. 2024. Ein neuartiges fluoreszierendes Proteinpaar erleichtert die FLIM-FRET-Analyse der pflanzlichen Immunrezeptorinteraktion unter nativen Bedingungen. Zeitschrift für experimentelle Botanik 75, 746-759. https://doi.org/10.1093/jxb/erad418

Mareike Jezek

Dr. Jezek ist stellvertretender Herausgeber des Journal of Experimental Botany, einer der offiziellen Zeitschriften der Gesellschaft für Experimentelle Biologie.